氨基酸活性中心判断（酶活性中心氨基酸有什么特点）

从活性中心和必需基团的角度如何理解酶的结构与功能之间的关系.

酶是大分子，其分子量一般在一万以上，由数百个氨基酸组成。而酶的底物一般很小，直接与底物接触并起催化作用的只是酶分子中的一小部分。即使有些酶的底物较大，但与酶接触的也只是一个很小的区域。所以，我们把酶分子中与底物结合并催化反应的场所称为酶的活性中心。

乳酸脱氢酶和底物

活性中心是由酶分子中少数几个残基构成的，它们在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同的肽链上，由于肽链的盘曲折叠而互相接近，构成一个特定的活性结构。因此活性中心不是一个点或面，而是一个小的空间区域。

酶的活性中心，引自百度百科

活性中心的氨基酸按功能可分为底物结合部位和催化部位。前者负责识别特定的底物并与之结合。它们决定了酶的底物专一性。后者是起催化作用的，底物的敏感键在此被切断或形成新键，从而生成产物。二者的分别并不是绝对的，有些基团既有底物结合功能又有催化功能。

Koshland将酶分子中的残基分为四类：接触残基负责底物的结合与催化，辅助残基起协助作用，结构残基维持酶的构象，非贡献残基的替换对活性无影响，但对酶的免疫、运输、调控与寿命等有作用。前二者构成活性中心，前三者称为酶的必须基团。

糜蛋白酶与TCK

活性中心以外的部分并不是无用的，它们能够维持酶的空间结构，使活性中心保持完整。在酶与底物结合后，整个酶分子的构象发生变化，这种扭动的张力使底物化学键容易断裂。这种变化也要依靠非活性中心的协同作用。

一般单体酶只有一个活性中心，但有些多功能酶具有多个活性中心。大肠杆菌DNA聚合酶I是一条109 kd的肽链，既有聚合酶活性，又有外切酶活性。下图是一种芽孢杆菌的DNA聚合酶I，聚合酶活性中心位于左侧与DNA结合的结构域，外切酶活性中心位于右侧结构域。

芽孢杆菌DNA聚合酶I

活性中心的基团反应性常与其他基团不同，所以一些试剂可以专一性地与活性中心中的某种残基反应，而不与活性中心外的残基作用。如DFP（二异丙基氟磷酸）只能与活性中心中的丝氨酸反应。而TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）的专一性更强，只能与糜蛋白酶活性中心的His-57结合，称为亲和标记。

糜蛋白酶与TCK的相互作用

当没有专一性试剂时，可用差示标记法：先用底物类似物保护活性中心，再加入修饰剂，与活性中心以外的基团反应，然后除去底物类似物，再加入同位素或荧光标记的试剂，此时试剂只能与活性中心的基团反应，所以被标记的就是活性中心。

紫外、荧光、园二色光谱等方法也可用与活性中心的研究。在酶与底物结合时，位于底物结合部位的生色团必然会发生某种变化，从而导致其光谱的变化。这些生色团可以是酶本身带有的，也可以人工引入。这种方法可以用来判断活性中心的构成，也可以研究催化的反应过程。

酶的活性中心有何特征?如果有两个丝氨酸残基,一个位于活性中心,一个位于酶的表面,用什么方法区分?

一般认为活性中心主要由两个功能部位组成：第一个是结合部位,酶的底物靠此部位结合到酶分子上；第二个是催化部位,底物的键在此被打断或形成新的键从而发生一定的化学变化.组成功能部位的是酶分子中在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团,它们在一级结构上可能相距甚远,甚至位于不同肽链上,而是通过肽链的盘绕、折叠在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说,辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构也是功能部位的组成部分.

一个是残基一个游离

酶活性中心的测定方法

测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等。

1.化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显著下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。

2.动力学分析法：酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用。另外，改变反应温度求出Vmax和Km与pH关系，从而求出有关基因解离的DH，DH的求得有助于补充pK值对活性中心的判断。在有机溶剂存在条件下，测定酶pK值与介电常数的关系，也有助于对活性部位的判断。

3.X－射线衍射分析法：化学修饰法和动力学分析只能推断酶活性部位氨基酸残基的数目，活性中心空间结构的信息，则需用X－射线衍射法。采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。

4.蛋白质工程：蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进的方法。蛋白质工程实质是按照人们的设想，通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。利用基因定点突变技术将酶相应的互补DNA（cDNA）基因定点突变，突变的cDNA表达出被一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为酶活性所必需。此方法可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基和不引起底物和活性中心结合的立体障碍，以及可人工地造成一个或几个氨基酸的缺失或插入，了解肽链的缩短或延长对酶活性的影响和定点改变酶蛋白的糖基化位点或磷酸化位点，从而了解糖基化或磷酸化对酶结构和功能的影响。