用茚三酮显色法测定植物游离氨基酸总量时为什么要加入抗坏血酸溶液
为了避免空气中氧气干扰显色反应，加抗坏血酸为还原剂，提高反应灵敏度，并可以使颜色稳定，但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应，故应严格控制加入抗坏血酸的量。
用茚三酮显色法测定植物游离氨基酸总量时为什么要加入抗坏血酸溶液?
原理：茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测量570nm
处的吸光度来测定氨基酸的含量。可见，还原性茚三酮的重要性。通常购买不到还原性茚三酮（即使能购买到也由于不稳定（很易被氧化）不宜使用），而是用还原剂抗坏血酸将市售茚三酮还原成还原性茚三酮，这就是用茚三酮显色法测定植物游离氨基酸总量时为什么要加入抗坏血酸溶液的原因。
如何从植物中提取氨基酸？
先用蛋白酶和肽酶处理得到氨基酸，然后用有机溶剂萃取，再进行分馏。
一，植物中游离氨基酸的提取；
1，烘干材料中游离氨基酸的提取:
从植物的叶片、叶脉及种子中提取游离氨基酸一般先需要干燥处理,叶片、叶脉要在105~110摄氏度杀青,然后60~80摄氏度烘干、粉碎,过40目筛。一些研究者用75%或80%的酒精作溶剂从粉碎原料中提取氨基酸,也有用蒸馏水作萃取溶剂提取,提取的方法是常温或加热到一定温度(小于100摄氏度)用一定体积分数的萃取溶剂浸泡2~6h,或加热回流20~30min,为了使原料中的游离氨基酸尽可能得以溶解,提取过程需重复2~3次,然后合并提取液、过滤,蒸发掉乙醇,既得到了氨基酸粗提液。也有人采用蒸馏水作溶剂超声波提取提取的方法,或在室温下样品用50%乙醇浸泡微波萃取,然后离心过滤,若用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量,常用2%~5%的磺基水杨酸水溶液浸提。
2，鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取：
鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取鲜叶片或鲜果肉一般用10%CH3COOH研磨或匀浆来进行提取,但由于鲜叶片或鲜果肉中的蛋白酶能水解蛋白质,造成游离氨基酸含量升高,故研磨要在冰浴中进行,新鲜材料中的脂、蛋白质、糖等易被提出,需加入一定的试剂除去。通常用10%三氯乙酸、一定浓度的醋酸铅、磺基水杨酸或95%乙醇加入过夜沉淀,然后离心或过滤的方法除去蛋白质,用乙酸乙酯或乙醚萃取以除去脂类等。
二，游离氨基酸的纯化；
从植物中提取的氨基酸粗提液中含有较多的色素、可溶性糖、有机酸及其他杂质,有必要对氨基酸粗提液进一步进行纯化,以便下一步进行氨基酸含量的测定。
最常用的纯化方法是用732阳离子交换树脂进行纯化。
732阳离子交换树脂在使用前要进行预处理,用一定浓度的盐酸浸泡树脂24h以上,然后用蒸馏水漂洗至中性,为的是除去树脂中的杂质,并使其完全转化成氢型阳离子交换树脂,湿法装柱,注意树脂间不能存有气泡,把氨基酸粗提液经适当浓缩到小体积后,倒入树脂柱中,让其缓慢流入树脂层,当氨基酸植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法粗提液全部进入树脂后,停留10min,以便使氨基酸充分结合到树脂上,接着用一定量的蒸馏水冲洗树脂,以吸取色素、水溶性糖等杂质,当流出液变清后,用0.5~4mol/L的氨水进行洗脱,收集洗脱液至用茚三酮检测无色为止。把洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干。用0.1mol/L盐酸溶解并定容之一定体积即可。该方法氨基酸损失,纯化效果好,故最常用于植物中提取的游离氨基酸的纯化。
也有研究者用活性炭进行纯化,把具有较强吸附能力的活性炭直接加入到氨基酸粗提液中,加热一段时间,然后过滤,以除去色素等,但活性炭对部分氨基酸也能吸附,造成氨基酸的损失
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