氨基酸层析分离（氨基酸层析分离原理）

氨基酸的纸层析分离原理是什么？

纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：

在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。

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避免氨基酸纸层析分离中出现“拖尾”现象，应注意实验操作中的哪些环节？

拖尾现象是指展层,显色后在层析分配图上,所看到的某一种氨基酸的分子位移,不是如标准图谱所示的那样,完整地显示在某一位置上,而是形成象笤帚似的那样,前端粗圆而逐渐细小下来,宛如拖着一个尾巴.其图所呈颜色也是由浓渐淡.其图象的出现,原认为是在实验中,对影响Rf值的主要因素要求,掌握不够所致.诸如,物质结构与极性对Rf值的影响,层析溶剂对Rf值的影响,PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值),温度对Rf值的影响,滤纸的质地是否均匀,薄厚是否适当,纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响,展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响.然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求,都仍不可避免地要出现拖尾现象.此时,这就需要从具体操作规范方面,诸如样品的处理,点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索,经仔细分析,样品的处理是为除去杂质纯化样品,达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下

进行,使样品达到一个适当的位移,便于在显色后从图象上,区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的,与水不相混合,并挥发性较快的 邑剂喷雾后迅速吹干的.更何况显色剂又是含水量极低,不会影响洋品的斑点扩散,那么问题就集中在点样这个操作程序上了.点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液,和为了对照实验结果,而分别配制的几种氨基酸的溶液,用微量点样管或毛细管,或血球计数器将5一j5微升的样品,点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去.点样后要自然风干,或冷风吹干.最好不要用加热装置,如吹风机,灯泡之类的热源将其样品点加速干燥.因为加热装置在学生操作时,一但注意不够,掌握不好,则温度升高势必要使样品破坏,更会使佯品点干的太燥.正是由于这样,样品点太干燥,使其样品物的分子,牢固地吸牢在层析纸的纤维上.所以在展层过程中,样品点的每个物质分子,不能在层析纸上同时起步,而是形成了有先有后,鱼贯而上行或下行的状况,最终使洋品物质的分子,不能同时都集中到达一个位置.致使在显色后,实验结果的图象上,观察到的不是一个完整的斑点,而是一个拖着尾巴的斑点.这就是上述所说的拖尾现象.

卤、结束语 ’

纸上分配层析所出现的拖尾现象,究其原因很简单,就是在点样品后,样品点吹的太干燥所致.原因太简单了,往往被人们容易忽略,更引不起人们的重视.但它确实在困扰着人们的实验效果.

氨基酸的纸层析分离，将层析滤纸干燥以后，为什么再用手碰过后还会留下颜色

氨基酸的结构如下：

RCH(NH2)COOH.

含有氨基NH2和羧基COOH的化合物，因此很难挥发。

干燥滤纸仅仅是溶剂挥发了，而氨基酸仍然保留在滤纸上，因此，当触摸后会有颜色留下（因为你手上会有人体排出的蛋白，脂肪，和肽一类的物质，而发生颜色反应。）

氨基酸的分离鉴定–纸层析法 有什么注意事项

样品中可能含有这3种氨基酸氨基酸是指样品主要是这三种氨基酸还是微量杂质是这三种氨基酸，这是不一样的。

如果样品就是这三种氨基酸的一种或几种组成，那直接氘水溶了打个核磁就好了，比例也有了。

如果是复杂样品含有这三种氨基酸，那基本只能用hplc了，接不接ms看样品，hplc分离这些还是很简单的，典型的就酸性磷酸盐缓冲液/乙腈，柱子可以选比如Waters的BEH-Amide柱或者CORTECS HILIC柱走HILIC条件，这3种氨基酸除了天冬氨酸外都是偏中性烷基侧链的，用Waters的CSH C18柱或者CORTECS C18+柱这类表面带电颗粒的柱子走反相应该也是可以的。

先说加入15%三氯醋酸的必要性：作为一种蛋白质沉淀剂，它能将混有的蛋白质沉淀而除去，避免进行纸层析时混有的蛋白质和茚三酮溶液反应干扰实验。

其次，题主先搞明白纸层析的原理。由于产物中的丙氨酸比谷氨酸极性弱，由相似相容原理，丙氨酸会更易溶于流动相即酚溶液（非极性）中得以分离。而加入的三氯醋酸会使得丙氨酸带上正电荷，和谷氨酸极性的差别变小，不易通过纸层析分离。

纸层析分离氨基酸时,为什么有的氨基酸几乎静止不动?

纸层析分离氨基酸时，有的氨基酸几乎静止不动的原因：纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离，在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

氨基酸纸层析法

中指的是在蛋白质氨基酸的组成分析中引入了纸层析分析的技术，使氨基酸分析获得了决定性的进展。在滤纸纤维上吸附着一层水保持成为固定相，另一部分是能溶于水的有机溶剂，如苯酚或正丁醇作为流动相，它沿着滤纸长的方向向上或向下流动。

将蛋白质和氨基酸分离所用的层析技术有哪些？

膜分离技术，尤其是超滤膜技术已经用于蛋白质和蛋白质水解液中酶、多肽以及其他大分子有机物的分级分离。但是分子量相近、物化性质相似的多肽很难用超滤膜进行分离。

纳滤膜分离技术则对多肽和氨基酸的分级分离具有明显的优势。纳滤膜具有纳米级孔径，截留分子量在100-1000Da之间，主要特征是表面带(正或负)电荷，小分子多肽和氨基酸相对分子量在100-1000Da都是两性电解质，分子中既带有碱性基团(氨基)，有带有酸性基团(羟基)。在溶液pH等于它们的等电点时，分子呈现电中性，净电荷为零;在pH偏离等电点时，分子成为带负电荷或正电荷的离子。