抑菌氨基酸

最新研究-抗菌肽对生姜根腐病的病原菌鉴定及防治效果

抗菌肽在农业上的作用 植物免疫诱抗蛋白（逆腾-预控）与农药、杀菌剂类产品的区别？

生姜是一种重要的香辛料, 而且具有很高的食用和药用价值。根腐病是生姜生产过程中危害性较大的一种土传病害, 主要致病菌为腐霉菌、镰刀菌等真菌和肠杆菌、芽胞杆菌、等细菌。根腐病可导致生姜减产50%~80%, 甚至绝产。目前生姜根腐病的防治措施主要是化学防治, 常用的药剂有精甲霜·锰锌、恶霉灵等, 但过量使用化 学农药会严重影响人类健康, 且产生致病菌耐药性等问题, 因此寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用人员的共识。

抗菌肽是一类短序列多肽, 氨基酸残基一般少于 50个。微生物抗菌脂肽是抗菌肽的一种, 是微生物产生的、有抑菌作用的代谢产物, 由氨基酸链 和脂肪酸链组成。抗菌脂肽对病原菌的作用方式分为作用于细胞壁、细胞膜或胞内物质。2018年夏季山东省潍坊地区出现强降水, 降水过后生姜根腐病病情严重, 生姜种植地受到感 染, 病害传播迅速, 难以遏制, 农民损失惨重。

为生物控制生姜根腐病, 我们采集病姜样本, 分离鉴定根腐病病原菌, 研究芽胞杆菌源抗菌脂肽对病原菌的抑菌作用, 并进一步探究其对生姜根腐病的离体防效, 为生姜根腐病的生物防治提供理论依据和技术参数。于2018年9月从山东省潍坊市安丘市生姜种植地采集典型的根腐病发病生姜样本, 带回实验 室进行病原菌的分离、培养。

第一步鉴定病源菌：

首先从病姜中分离得到1株疑似致病真菌O, 将其接种于健康的生姜块茎横切面(图 1-a), 生 姜产生明显的病变, 生姜横切面出现水渍状、褐色病斑, 与菌丝接触的部位出现凹陷, 组织变软, 并伴有臭味(图 1-b)。随后, 将疑似病原菌O接种于生姜植株, 病原菌接种组在第3天开始出现发 病症状, 自下而上变为褐色水渍状, 最终倒伏(图 1-c、d), 无菌水对照组未发病(图 1-e)。分别从 离体块茎和活体块茎中再次分离到病原真菌, 并对该真菌形态进行观察, 其菌丝形态结构与疑似病原菌O完全相同。根据科赫法则, 可证明菌株O为生姜根腐病的病原菌。

a、e.对照组; b.离体接种组; c.接种后第3天的发病症状; d.接种后第6天的发病症状。

病原菌O在PDA培养基中生长迅速, 30 ℃培养48 h即可在直径9 cm的平板中长满白色菌丝, 菌丝茂密。在Petri培养液的诱导下病原菌可产生孢子囊、卵孢子和游动孢子(图 2)。显微镜观察 菌丝无隔膜, 直径1.60~5.98 μm(平均3.13 μm); 藏卵器球形, 偶有2~3个串生, 直径 19.82~33.47 μm(平均26.86 μm), 每个藏卵器附着多个雄器, 雄器与藏卵器异丝生; 卵孢子球形, 壁厚1.12~4.04 μm(平均2.41 μm), 孢子囊指状膨大, 直径4.25~11.12 μm, 长度294.62 μm; 游 动孢子肾形, 游动停止后迅速变为圆形的休止孢子; 休止孢子球形, 萌发产生芽管, 直径 6.54~10.39 μm(平均9.13 μm)。根据形态学特征，初步鉴定生姜根腐病病原菌为群结腐霉。

.菌丝; b、c.孢子囊; d.雄器和卵孢子; e.休止孢子; f.孢子的萌发。标尺=20 μm。

第二步：验证抗菌肽对病源菌的影响

用抗菌肽处理将要发育出孢子囊和卵孢子的菌丝, 处理12 h后, 相较于未处理的对照组(图 4-a、b), 发现未发育出孢子囊(图 4-c)及卵孢子(图 4-d), 说明抗菌肽抑制了群结腐霉营养体的生长和生殖结构的发育。

第三步利用扫描电镜观察结构变化：

抗菌肽对群结腐霉菌丝微观形态的影响(图 5)。在菌丝形态上对照组与抗菌肽处理组明显不同。对照组的菌丝饱满、完整、均匀(图 5-a), 而经过抗菌肽处理的菌丝表面出现了明显的褶皱和枯萎(图 5-b), 说明抗菌肽可以改变群结腐霉菌丝的微观形态, 可能是由于抗菌肽增大群结腐霉细胞膜通透性, 导致胞内物质泄露,从而使菌丝产生褶皱和萎缩。

研究结论：

本次研究通过组织分离方法从山东潍坊发病生姜中分离出根腐病病原菌, 并利用Petri培养液诱 导出孢子囊和卵孢子, 进行了形态学鉴定, 并结合分子生物学鉴定手段鉴定出该病原菌为群结腐霉(Pythium myriotylum)。表明群结腐霉多年来一直存在于潍坊生姜种植地块。

目前化学杀菌剂的优点有杀菌性强, 见效快等。但是, 化学杀菌剂的过量使用会导致病原菌产生耐药性, 容易有残留对人类健康产生影响，尤其影响食品安全。

生物防治是一种有力的替代化学防治的方法。已有研究发现表明抗菌肽可以作为瓜果腐霉病及番茄辣椒立枯病的生防药剂。然而, 目前尚未有利用抗菌肽防治群结腐霉引起的生姜根腐病的报道。

抗菌肽是由本公司实验室保存的, 此产物首先从侧孢短芽胞杆菌发酵液中分离鉴定, 是一种阳离子线性脂肽; 对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都具有较好的抑菌活性。因此本研究分别测定了抗菌脂肽对群结腐霉的抗菌活性, 结果表明, 抗菌肽处理可抑制群结腐霉生殖结构的发育, 进一步研究发现抗菌肽处理改变了其细胞膜的通透性, 使其胞内物质泄露, 菌丝表面褶皱, 进而 产生抑菌作用。通过人工接种生姜离体切片验证了抗菌肽在土壤环境下对生姜根腐病中有 一定的防控效果。本研究鉴定的山东潍坊生姜根腐病病原菌为群结腐霉, 确定了抗菌肽对群结腐霉的抑菌作用及离体防治效果, 为生姜根腐病的生物防治, 保障食品安全和减少环境污染提供了科学实验依据。

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