氨基酸测定色谱
柱前衍生化试剂
1.产品名称
具有柱前衍生的漾林氨基酸分析仪
2. 目的
分析仪可以使用自动进样器混合分析氨基酸作为OPA试剂的柱前衍生物。分析仪可以使用自动进样器混合分析氨基酸作为OPA试剂的柱前衍生物。它还能够检测氨基酸水解的存在，例如在蛋白质，胶原蛋白，肽和加工食品中发现的氨基酸。
3. 分析原理
1) 氨基酸定义
氨基酸是一种包含一个氨基（NH2）与一个羧基（COOH）跟其他变量基团用R符号代替，R基团可以是氢原子一样（甘氨酸），或者R-基团可以是具有各种官能团的碳骨架。氨基酸的分子基本结构式：
氨基酸基本结构式: R-CH(NH2)-COOH
17根据氨基酸的结构特点，可以看到氨基酸包含三个基团：氨基基团，羧基基团，以及侧链基团。值得注意的是，具有基本结构式的有22种必须氨基酸，其中17中为一类氨基酸，5种为二类氨基酸。
氨基酸
氨基酸是构成蛋白质的基础分子，它们首先形成肽或多肽的短聚合物链，然后组合在一起形成蛋白质。 二十种氨基酸由标准遗传密码编码，通常称为标准氨基酸。 人体产生更复杂的氨基酸，称为非标准氨基酸。
已经确定二十二个氨基酸对生物系统很重要-甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苏氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，半胱氨酸，组氨酸，蛋氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，2-酪氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，脯氨酸和氧脯氨酸。必需氨基酸是人体不能通过化学反应从其他化合物合成的氨基酸。在人类中，必需氨基酸包括赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，以及儿童具有的组氨酸和精氨酸。
检测氨基酸
（1）由于存在三种芳香族氨基酸（色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸），紫外（UV）分光光度法很容易定量蛋白质，但是这类氨基酸在蛋白质中只占很小一部分。其他19种氨基酸是非芳香族的，不能用紫外分光光度法检测。这就需要构建那19个氨基酸的衍生物，让其可以通过UV / VIS分光光度法检测和定量，这种方法可间接检测和定量这19种氨基酸。
(2) 构建氨基酸衍生物的试剂
– 茚三酮
– OPA（邻苯二甲醛）
– PITC（异硫氰酸苯酯）
– FMOC（芴基甲氧基羰基氯）
2) 柱前衍生化
l OPA 方法
该方法利用OPA试剂构建氨基酸衍生物，该衍生物易于通过UV / VIS分光光度法检测和测量。 OPA试剂与游离氨基酸反应，进而游离氨基酸可以通过柱中的阳离子交换而分离。氨基酸衍生物在室温下以与茚三酮法不同的方式构建。 异吲哚在紫外光下发出荧光，当第一个氨基酸与OPA试剂和硫脲反应时产生，就可以通过UV / VIS荧光方法检测氨基酸。
使用OPA试剂的反应过程
4. 分析方法
1) 样品制备
a. 确定样品量（例如：将200毫克酱油放入样品瓶中）
b. 向小瓶中加入30ml 6N HCl。将样品在130℃保温24小时以水解氨基酸。
c. 通过加入50ml纯净水稀释水解的样品。
d. 取1ml样品，装入2ml进样瓶中。
e. 干燥后, 将1ml硼酸盐缓冲液（或0.02N HCl）加入小瓶中并摇动。
f. 用0.2um的注射器过滤器过滤样品。
2) 分析条件
a. 自动进样器混合条件:
泵 : 渐变流速: 2ml/min
紫外/可见光检测器: 338nm
色谱柱 : C18( 4.6mm 150mm, 5um)
b. 自动进样器混合条件:
泵 : 渐变流速: 1.2ml/min
紫外/可见光检测器r : 338nm
色谱柱 : C18 (4.6mm 150mm, 3.5um)
5. 分析器配置
(1) YL9150 自动进样器
(2) 四元泵，YL9110
(3) 4通道真空脱气机, YL9101
(4) 柱室， YL9131
(5) 紫外/可见光检测器或荧光检测器， YL9120
(6) 数据系统(YL-Clarity 软件 or Autochro-3000)
(7) OPA试剂盒
(8) HPLC 执行组件 (安装套件)
(9) 脱溶剂套件
(10) 注射器过滤器0.2um
6. 色谱图
[17 kinds of Amino acids standard, with C18 column 4.6x150mm, 5um]
1.天冬氨酸2.谷氨酸3.丝氨酸4.组氨酸5.甘氨酸6.苏氨酸7.精氨酸8.丙氨酸9.酪氨酸10.胱氨酸11.缬氨酸12.蛋氨酸13.色氨酸14.苯丙氨酸15.异亮氨酸 16.亮氨酸17.赖氨酸
[17 kinds of Amino acids standard, C18 4.6x150mm, 3.5um]
7. 应用
· 生命科学：蛋白质结构，合成肽鉴定
· 制药：注射用药，营养药物
· 食品和饮料中必需氨基酸的测量
· 临床：诊断氨基酸水平和缺陷
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