氨基酸短肽测序
2022年七大前沿科技：量子模拟和靶向基因医疗！
《自然》杂志最新列举2022年七项重要科学技术，将对科学领域产生重大影响，其中包括：
图一：完整版基因组
2019年，美国加州圣克鲁兹分校基因组学研究员凯伦·米加（Karen Miga）和马里兰州贝塞斯达国家人类基因组研究所研究员亚当·菲利普（Adam Phillippy）启动了“端粒至端粒（T2T）”的联合研究项目，当时大约全球十分之一的人类基因组仍未完成测序，然而，现在该数据已降至零。2021年5月，该联合研究项目声称发现第一个端粒至端粒的人类基因组序列，使用人类共识基因组序列图谱GRCh38增加了近2亿新碱基对，并为人类基因组计划写上了最后一章。
图二：解析蛋白质结构
此前研究人员很难衡量蛋白质的结构功能，在过去两年时间里，科学实验和计算领域取得的进步，为研究人员以前所未有的速度和分辨率解析蛋白质结构。由DeepMind子公司Alphabet开发的AlphaFold2结构预测算法基于“深度学习”策略，能推算出氨基酸序列折叠蛋白质的结构。该算法自2021年7月发布以来，已被应用于蛋白质组学，用于确定人类和20个模型生物中表达的所有蛋白质结构，以及Swiss-Prot数据库中近44万个蛋白质结构，大幅增加了高可信度建模数据的蛋白质数量。
图三：量子模拟
原子在特定条件下，能被诱导至一个高度激发状态，直径达到1微米或者更大。目前物理学家现已证实，通过对数百个原子阵列进行这种可控激发，可以解决一些具有挑战性的物理问题，实现传统计算机“极限升级”。
图四：精准基因操控
尽管CRISPR–Cas9技术拥有强大的基因组编辑能力，但该技术更容易基因失活，而不是达到基因修复，因为尽管针对Cas9酶的基因组序列相对精确，但细胞对该技术产生的双链切割修复却并不精确，CRISPR–Cas9修复通过一种称为“非同源端连接”的过程进行，通常会被微小的基因插入或者删除所混淆。
图五：靶向基因治疗
基于核酸的药物可能会对临床治疗产生某些影响，但它们在可应用的组织方面仍受到限制，大多数治疗方法要么需要局部给药，要么需要体外操作，从患者体内提取细胞，然后将其移植到患者体内。一个显著的例子是肝脏，可以过滤血液，被证明是选择性药物输送的有效靶点，在这种情况下，静脉注射，甚至是皮下注射，均可达到该效果。
图六：空间多组学分析
单细胞组学的迅速发展意味着研究人员可以常规地从单个细胞中获得遗传、转录、表观和蛋白质组学的见解，有时是同时获取，但是单细胞技术在将细胞从原生环境中剥离过程中，也失去了关键信息。2016年，瑞士皇家理工学院乔基姆·伦德伯格（Joakim Lundeberg）设计了一种策略克服了该问题，他和同事使用条形码寡核苷酸（RNA或者DNA短链）制作载玻片，该载玻片能从完整的组织切片中捕获信使RNA，这样每个转录RNA可以依据条形码被分配至样本中的特定位置，他说：“无人相信我们能从组织切片中提取全转录RNA分析，但事实证明，该策略非常简单。”
图七：基于CRISPR技术的诊断
CRISPR–Cas系统技术精确切割特定核酸序列的能力源于它作为细菌“免疫系统”对抗病毒感染的作用，这种关联性激发了早期采用该技术的科学家考虑它对病毒诊断的适用性。美国麻省理工学院布罗德研究所、哈佛大学剑桥分校遗传学家帕尔迪斯·萨贝提（Pardis Sabeti）说：“利用它们在自然界中设计的功能非常有意义，毕竟它们已演化了数十亿年。”
提绳打水有妙用，DNA“牵手”多肽“穿行”纳米孔破解测序瓶颈
蛋白质是构建生命体的基本物质之一，在合成、催化和信号传感等所有生命活动中均承担着重要的功能。开发一种可靠、高效的蛋白质测序技术对于理解生命过程和揭示疾病机理而言至关重要。作为构成蛋白质的组成片段，多肽，成为打开蛋白质这扇大门的“钥匙”。
纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术，其中多肽纳米孔测序仍面临诸多挑战。近日，南京大学化学化工学院研究团队在国际知名期刊《纳米快报》杂志发表论文，他们利用纳米孔错位测序技术，像在水井里提绳打水一样，构建了多肽-DNA嵌合链，用DNA测序酶与DNA的结合，通过DNA的移动，带动多肽分子在纳米孔内的棘轮运动，从而实现了多肽的纳米孔测序，破解了技术瓶颈。
无法进行序列扩增，制约蛋白质测序灵敏度
蛋白质，组成人体一切细胞、组织的重要物质，可以说，没有蛋白质就没有生命。而蛋白质的功能是由蛋白质的序列决定的，序列的微小改变，可能导致蛋白质失去生物活性或者诱发疾病。
如果能为蛋白质测序，就可以确定蛋白质是否有序列变化，判断是否会对人类健康有影响。
“与核酸检测不同，目前蛋白质测序的难点在于，缺乏有效的序列扩增方法，技术发展上停滞不前，主要靠质谱法和埃德曼降解法来测序。”该篇论文的通讯作者、南京大学化学化工学院教授黄硕说。
通俗地说，质谱法是用生物酶将蛋白质分解成很多多肽片段，再通过质谱仪器检测，确定蛋白质片段的信息，最终将这些片段重构成蛋白质序列。而埃德曼降解法是用化学方法将蛋白质N端的一个氨基酸切下来进行鉴定，再进行第二轮的氨基酸切割和鉴定，多次循环操作后，确定氨基酸的序列。
但在黄硕看来，这两个方法都有局限性。“相较于DNA和RNA测序，构成蛋白质的氨基酸种类更多，质谱法的检测难度大于核酸测序。而对埃德曼降解法来说，它只能对单一的蛋白质样品序列解析，如果降解的样品纯度不够，混合有多种蛋白质样品，那么被切下来的氨基酸就会有很多种，就无法确定哪个氨基酸来自哪个蛋白质的，无法判断蛋白质的序列。另外，还有一些肽段的末端是封闭的，就不能用降解法。”黄硕介绍。
更重要的是，由于无法实现序列扩增，蛋白质测序的灵敏度度较低，这意味着无法检测自然界中一些丰度很低的蛋白质样品。黄硕认为，利用现有的技术，复杂环境中的蛋白质，难以直接测序，比如体液、土壤、水体中的蛋白质样品，要先做一些纯化、富集，达到测序的样品标准，才能在质谱仪中测序。同时，蛋白质的化学修饰很丰富，这也有可能干扰蛋白质测序。
借助DNA与酶的反应，牵引肽链在纳米孔中可控运动完成测序
能不能找到一种更微观的测序方式，只用一个分子就能为蛋白质测序？从2015年开始，纳米孔测序技术进入黄硕课题组研究视野。
纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术，已在DNA和RNA测序方面取得成功，它通过让单链的核酸通过纳米孔，通过纳米孔内的检测器获得核酸链的碱基信息。
“如果能在单分子水平上为蛋白质测序，将为检测低丰度蛋白和单细胞蛋白质组学提供极高的灵敏度。”受此启发，黄硕课题组开始研究，用纳米孔测序技术，进行蛋白质或多肽的单分子测序。
但是多肽纳米孔测序仍面临诸多挑战，其中一个主要的困难是如何实现多肽在纳米孔中可控的棘轮运动，而这主要受限于目前没有和肽链相匹配、有很强的亲和力的多肽测序酶。
“棘轮运动指的生物高分子贴着纳米孔的内壁，顺着同一个方向做匀速、定向运动，类似于附着在齿轮内壁上移动一样，这需要找到一种酶来控制多肽的运动速度，从而控制它穿过纳米孔的速度，以精准测序。”
此前，黄硕课题组曾尝试对非天然核酸测序，但是苦于没有找到合适的酶来匹配棘轮运动，后来，他们突发奇想，利用纳米孔的错位效应来测序，并开创了纳米孔错位测序技术。
“核酸的纳米孔识别位点和酶的反应位点，有一个固定的约14-15个碱基的错位，这就形成了一个测序窗口，可以利用这个不受酶反应限制的窗口，实现多肽的测序。”黄硕说。
纳米孔错位测序技术能否应用在多肽测序领域？近期，黄硕课题组在技术验证时发现可行。在此次研究中，他们将多肽和DNA嵌合成一条链条，嵌合链的DNA部分为“牵引链”，在检测过程中，DNA测序酶与DNA结合，通过拉动DNA部分，牵动整条链条在纳米孔中的可控棘轮运动，实现多肽的纳米孔直接读取。
黄硕打了个比方，“这就相当于用绳子在井里提水桶，如果井是纳米孔的话，井绳就是DNA，水桶就是多肽。‘井口’的DNA测序酶拉动DNA在纳米孔内移动，而DNA又与多肽嵌合在一起，DNA的移动，也就直接拉动了多肽的移动，从而实现了多肽的纳米孔测序。”
黄硕介绍，经验证，多肽的纳米孔测序信号表现出高度的一致性和序列相关性，由单氨基酸替换引起的电流变化也能被清楚地检测到。通过将多肽的N端或C端与DNA驱动链进行偶联，实现了对多肽两端氨基酸序列信息的读取。
“这意味着，可以对蛋白质单分子进行测序，这为今后的蛋白质高通量测序，蛋白质重构，提供了一个全新的工具。”黄硕说，借助蛋白质序列研究，可以对蛋白质的功能进行预测，从而帮助理解、解释相关生命活动。(金凤)
来源： 科技日报
提绳打水有妙用，DNA“牵手”多肽“穿行”纳米孔破解测序瓶颈
速递 | 利用非天然氨基酸，新锐志在全面改良蛋白疗法
2021年11月3日，GRO Biosciences宣布完成2500万美元的A轮融资。GRObio旨在针对包括自身免疫和代谢疾病在内的慢性疾病，利用非天然氨基酸（NSAA）开发创新蛋白疗法，以持久逆转慢性疾病，使患者摆脱痛苦。蛋白疗法的产品稳定性、免疫原性和细胞递送仍然是有效治疗的重大障碍，而使用非天然氨基酸有望改善上述特征。本次融资获得的资金将用于支持其关键GRO技术平台的开发、临床前验证研究和IND启动研究，以提供更安全、更简单和更有效的蛋白疗法。
该公司专有的GRO平台，是基于基因测序和基因编辑先驱、哈佛大学医学院的George Church教授实验室的研究。GRO平台扩展可以用于构建蛋白质的氨基酸种类，超出了自然界中存在的20种氨基酸。GRO平台由基因组重编码微生物组成，这些微生物的基因组和蛋白质翻译机制都经过了基因编辑的修改，让它们能够高效，大规模地生产包含非天然氨基酸的蛋白生物制品。
图片来源：GRObio公司官网
此外，GRObio正在向两个方向推进包含非天然氨基酸的产品。其中，名为DuraLogic的技术旨在通过纳入非天然氨基酸，增强蛋白三维结构的稳定性。该平台使蛋白具有超长的作用持续时间，并能提供更稳定的药效学特征（治疗效果）和宽松的给药方案。
ProGly技术由携带聚糖的非天然氨基酸构成，它们可以诱导或者抑制免疫反应。GRO平台能够将它们精准地放置在蛋白质表面，以引发预定的免疫反应。该公司的第一批产品可以重新训练免疫系统，将蛋白质识别为“自身”或“非自身”。这是一种治疗自身免疫性疾病，或消除针对蛋白疗法的抗体的独特治疗模式。
GRO Biosciences的联合创始人兼首席执行官Daniel J. Mandell博士表示：“我们非常高兴能得到现有和新投资者的支持，以开发一种扩展的氨基酸字母表，克服目前蛋白疗法的挑战，为无数患者改善健康状况。”
参考资料:
[1] GRO Biosciences Announces $25M Series A Financing Led by Leaps by Bayer and Redmile Group. Retrieved November 3, 2021, from 网页链接
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