氨基酸分析柱
气相色谱柱温与检测器温度
2019/07/11 作者/ EWG1990仪器学习网
一、柱温的选择
柱温是最重要的色谱操作条件之一，它直接影响色谱柱的选择性、色谱峰区域展宽和分析速度。柱温不能高于固定相的最高使用温度，否则会造成固定相的大量挥发流失；柱温也不能低于固定相的熔点，以免影响其分配作用。柱温的选择，要依据具体情况而定：若分离是关键，则应采用较低的柱温；若主要研究的是分析速度，则应采用较高的柱温；若既要获得较高的分离度，又要缩短分析时间，一般采用较低的柱温与较低的固定液配比相配合的方法。
液相色谱中，一般在室温条件下进行分离分析，适当提高柱温有利于改善传质和提高分析速度。
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二、检测器的选择
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。理想的检测器应具有灵敏度高、重复性好、响应快、线性范围宽、适用范围广、对流动相温度和流量的变化不敏感、死体积小等特点。在液相色谱中，有两种类型的检测器。
一类是溶质型检测器，如紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。紫外检测器具有很高的灵敏度，即使是那些对紫外光吸收较弱的物质也可用来检测。紫外检测器对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱，但不适用于对紫外光完全不吸收的试样。荧光检测器比紫外检测器的灵敏度要高2个数量级，许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长更长的荧光，例如多环芳烃、B族维生素、黄曲霉素、卟啉类化合物等，许多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类、甾族化合物都可用荧光检测器检测。
另一类是总体检测器，如示差折光检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。几乎每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用示差折光检测器来检测，它是一种通用型的浓度检测器，但是对温度变化很敏感，不能用于梯度洗脱。
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三、注意事项
1、流动相
由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此，每次开始检测新样品时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般调至保留时间为6～15min 为宜）。所以建议第一次检验时少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，注意充分平衡柱。流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维；有则重新滤过。尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。
2、样品配制
塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品溶液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
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3、记录时间
第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如 30min 以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论塔板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4、进样量
药品标准中常标明注入10μL，而目前多数 HPLC 系统采用定量环（10μL、20μL 和 50μL），因此应注意进样量是否一致（可改变样液浓度）。
5、计算
由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐，有些含水量不同，有些是盐基不同，有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6、仪器的使用
（1）柱在线时，增加流速应以 0.2mL/min 的增量逐步进行，一般不超过1mL/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，出现叉峰。柱不在线时，要加快流速也需以每次 0.5mL/min 的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
（2）安装柱时，注意流向，接口处不要留有空隙。测定完毕用水冲柱1h，甲醇冲柱30min。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1～0.3mL/min）冲洗过夜（注意水要够量），无须用甲醇冲洗。另外，需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5%～20%甲醇的水冲洗，再用纯甲醇冲洗。冲水的同时用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水或10%异丙醇）。
7、波长选择
首先在可见-紫外分光光度计上测量样品液的最大吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其他物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在 HPLC 中的响应值，如吸光度小于0.5，HPLC 测定的面积将会很小。
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