9b氨基酸(Anal Chem一种检测体内γ-谷酰基转肽酶的可活化化学发光探针)

近日，南京大学叶德举课题组成功合成了一种检测体内γ-谷酰基转肽酶的可活化化学发光探针，可以在与靶向分子相互作用时显示出增强的化学发光，这在低背景、高灵敏度和提高生物组织穿透深度方面为传感和生物成像提供了有前途的工具。探针与GGT相互作用后，在水溶液中实现800倍以上的强化学发光，可在体外和活细胞中特异性检测，还可以在活体小鼠体内对血清中GGT进行定量。此外，设计的探针可以对活体小鼠静脉给药后的GGT阳性肿瘤进行实时化学发光成像。研究表明，GGT活化的化学发光探针在血清检测和分子成像方面具有巨大的潜力，在GGT相关疾病的诊断中具有广泛的应用前景。该研究成果在Anal. Chem. 上发表。（DOI:10.1021/acs.analchem.9b02839）

在过去的几年里，化学发光已经成为一种很有前途的传感和成像工具，其不需要外部光源的实时激发，因此几乎不存在自荧光干扰，可以实现极高的信号背景比，提高体内成像的灵敏度。而γ-谷酰基转肽酶(GGT)是一种蛋白酶，参与许多重要的生理过程，许多疾病与GGT活性异常密切相关。血清GGT活性测定是临床血液检测的常规方法。此外，许多恶性肿瘤也发现GGT过表达。因此，准确测量GGT活性并显示其位置对疾病诊断和癌症治疗具有重要意义。

Shabat和Lippert等人对Schaap（一类经典的化学发光分子）的化学结构进行了合理的修饰，使其在生理条件下与感兴趣的生物分子相互作用时发出强烈的化学发光。在此，作者使用修改过的Schaap开发了第一个由GGT激活的化学发光探针1，该探针可以高灵敏度和特异性检测血清、肿瘤细胞和小鼠中的GGT活性。GGT激活的化学发光探针的总体设计如图1所示，由一个与GGT响应可断裂的底物氨基酸γ-Glu、一种高度自发光的丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯发光体和一个连接物对氨基苄醇(PABA)组成。γ-Glu是一个特定的GGT底物,被广泛应用于设计各种针对GGT的探针。丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯具有高化学发光量子产率，可以在生理条件下于体内有明亮的黄绿色化学发光成像。使用PABA连接γ-Glu和发光体，可以有助于减小探测器的位阻，促进其与GGT的活性位点的相互作用。GGT断裂底物氨基酸γ-Glu后，探针1转换成中间体2。之后又经历自发的消除过程和去质子化，以及破坏过氧化物键，最终产生荧光产物5，并伴有约540 nm处的发光。因此，可以通过GGT选择性地开启亮黄绿色的化学发光，从而检测活细胞和老鼠体内的GGT活性。

图1.GGT活化的化学发光探针1的化学结构以及化学转化。（图片来源：Anal. Chem.）

作者首先研究了探针1在GGT酶的缓冲液中对GGT的反应。探针1最初在350 nm处有微弱的紫外吸收和微弱的荧光。与GGT孵育6小时后，在约400 nm处出现一个新的吸收带，并伴随着约540 nm处的强荧光发射。反应液的吸收光谱和荧光光谱与化合物5相同，随后的HPLC分析表明，探针1 (HPLC保留时间，TR = 10.4 min)几乎完全转化为产物5 (TR = 7.0 min)。然后作者测量了GGT孵育前后探针1的化学发光发射光谱。探针1本身无化学发光，但30 min后，在540 nm波长处观察到明显的化学发光，且最大发射值为540 nm。GGT诱导的化学发光率约为876倍。GGT孵育后探针的化学发光动力学曲线显示信号迅速增加，在30 min左右达到最大值。相比之下，没有GGT时，探针1在测量过程中几乎没有化学发光。这些结果表明，GGT可以有效地激活探针1，产生显著的化学发光。

图2. (a) 酶缓冲液中GGT孵育前(实线)和孵育后(虚线)探针1的紫外吸收(黑色)和荧光光谱(红色)。(b)用高效液相色谱法对GGT孵育前(黑色)和孵育后(红色)的探针1进行分析。(c) GGT孵化之前(黑色)和之后(红色) 探针1的化学发光光谱和图像。(d)加或不加GGT孵育后探针1的化学发光动力学特征。（图片来源：Anal. Chem.）

在证实探针1对GGT的化学发光反应后，下一步检测了探针检测GGT的敏感性。不同浓度GGT孵育探针1，可以看出随着GGT浓度的增加，化学发光图像变亮，化学发光强度与GGT浓度呈良好的线性关系。接下来，作者测试了探针1对GGT的特异性，当探针1与其它酶或ROS孵育时，化学发光变化不大，说明探针是GGT的特异性化学发光探针。然后，作者使用探针1测定了脂多糖处理前后小鼠血清中GGT的活性（据报道，用从革兰氏阴性菌壁中纯化的内毒素脂多糖(LPS)处理小鼠，可引起感染性肝功能障碍）。用未处理的小鼠血清孵育后，探针1的平均化学发光量为599 ± 125 (RLU)，据此计算健康小鼠血清中GGT的平均活性估计为1.6 U/L。用LPS处理小鼠时，血清中GGT水平为3.8 U/L，是正常血清的2.4倍。这些结果与用于GGT的商用荧光探针AMC-Glu的测量结果一致，表明探针1用于GGT检测的可靠性。

图3.(a)不同浓度GGT孵育后探针1的化学发光图像。(b)平均化学发光强度与GGT浓度的线性拟合曲线。(c)探针1对GGT的特异性响应。(d) 1号探针在血清中孵育的化学发光强度。(e)根据(d)中的化学发光强度定量血清中GGT活性。（图片来源：Anal. Chem.）

然后用GGT过表达的OVCAR5和U87MG癌细胞与探针1孵化，显示化学发光逐渐增强。最强信号出现在15 min,可持续45 min。在60 min时，与HUVEC细胞相比，OVCAR5和U87MG肿瘤细胞中的化学发光图像更亮。OVCAR5和U87MG肿瘤细胞的平均化学发光强度分别是HUVEC细胞的29倍和23倍。这些结果表明探针1是有效的，可以实时检测GGT在活细胞中的活动，从而不仅可以区分肿瘤细胞和正常细胞，也可以在不同肿瘤细胞系通过敏感的化学发光成像区分GGT水平。

图4.(a) 活细胞与探针1孵化后实时测量的化学发光强度 (b) 细胞板的化学发光图像。(c) OVCAR5细胞的荧光成像。（图片来源：Anal. Chem.）

受探针1在活肿瘤细胞中检测内源性GGT的高敏感性启发，作者随后研究了通过GGT活性的化学发光成像在体内和体外测定OVCAR5细胞数量的能力。不同数量的OVCAR5细胞与探针1孵化30 min，细胞数越多，亮度越大，发光强度与孔内细胞数量之间存在良好的线性关系。接下来，作者研究了在体内检测OVCAR5细胞数量的能力。不同数量的OVCAR5细胞和探针1皮下注射到老鼠体内，30 min后获取全身化学发光图像。注射部位的化学发光信号随细胞数量线性增加。说明探针1对活体小鼠中OVCAR5细胞数量的检测也是可行的。

图5.用探针1在体内外检测OVCAR5肿瘤细胞，化学发光强度以及OVCAR5细胞数量的线性拟合曲线。（图片来源：Anal. Chem.）

总结：南京大学叶德举课题组合成了一种GGT活化的化学发光探针，并证明了其在体内外检测GGT活性的潜力。研究表明，探针在生理条件下稳定，和GGT在水溶液中反应后在540 nm出现强化学发光，可以高敏感性和特异性测定用LPS处理过的小鼠血清中的GGT水平。且该探针在体外和活体小鼠体内都可以检测到GGT相关的肿瘤细胞，敏感性比荧光成像有了很大的提高。在未来，该探针可以作为一种化学发光检测手段，用于临床血液样本中GGT活性的检测，以及研究活体受试者中与GGT相关的生理和病理过程。