氨基酸总量测定（氨基酸总量测定结果分析）

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1、氨基酸总量检测是为什么要加入甲醛

2、测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些？为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分？

3、测定氨基酸含量的方法有几种

氨基酸总量检测是为什么要加入甲醛
氨基酸的测定一般使用凯氏定氮法，最后滴定的是NH4+。由于NH4+酸性不够，需要加入甲醛使其反应产生六次甲基四胺，以增强NH4+的酸性。

　　测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些？为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分？
一般来说人体必须的17种氨基酸，也较为重视

　　氨基酸的定性测定

　　一、氨基酸的一般显色反应

　　本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显

　　色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。

　　1. 茚三酮法

　　显色方法有下列数种：

　　①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用 5g/L 茚三酮无水丙

　　酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背

　　景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。

　　为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：

　　②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液显色。

　　③用 1g/L 茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。

　　④用 1g 茚三酮，600mL 无水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80

　　℃染色5～10min。

　　为了使显色稳定，可用下列方法：

　　⑤配制含醋酸镉 2g 加蒸馏水200mL 及冰醋酸40mL 的贮存液。将上述贮存液加200mL

　　丙酮及2g 茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓

　　硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点

　　也比较稳定。

　　⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也

　　可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。

　　2．吲哚醌法

　　（1）原理

　　各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没

　　有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。

　　（2）试剂

　　①显色剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度

　　稍差）。

　　②底色褪色剂：在 100mL 200g/L 碳酸钠溶液中加入60g 硅酸钠（Na2SiO3?9H2O）在水

　　浴（60～70℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸

　　钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容

　　易变黄，硅酸钠用得少（40g），虽裉色较慢，但背景较为洁白。

　　显色步骤

　　层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不

　　太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注

　　意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变

　　浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪

　　色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无

　　色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因

　　氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。

　　其他显色步骤：显色剂为 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸锌溶解于70～80mL 热异丙醇中，冷却

　　后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸锌溶解于95mL 热异丙醇中，加3mL 水，冷却

　　后加1mL 冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置10min，背景可用水

　　迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去

　　由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。

　　3．邻苯二甲醛法

　　邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可

　　用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根

　　据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达0.5μmoL，在硅胶薄层层析上为0.05～0.2μmoL。

　　这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源

　　比较困难，这里未作介绍）

　　（1）原理

　　邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

　　的激发光和发射光波长分别为340nm 和455nm。

　　各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

　　异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

　　酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。

　　（2）试剂

　　邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油

　　醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。

　　显色步骤

　　将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中 1min，冷风吹干，在温度18℃以下，

　　湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。

　　说明

　　在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以 0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以

　　便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显

　　不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。

　　二、个别氨基酸的显色反应

　　利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电

　　泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下：

　　1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应

　　(1)第一种方法

　　试剂：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。

　　②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。

　　显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨

　　酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。

　　(2)第二种方法：

　　试剂：①1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶

　　液中。

　　显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或

　　其他胍类物质显桔红色。

　　2．胱氨酸和半胱氨酸的显色

　　试剂：①1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2?5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液

　　中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每100mL 上述溶液

　　中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g 氰化钠溶于5mL 水中，

　　然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。

　　显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，5min 后半胱氨酸显红色。

　　胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱

　　氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。

　　3．甘氨酸的显色

　　试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。

　　显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力

　　棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被

　　保护后，以及其他氨基酸均不显色。

　　4．脯氨酸的显色

　　试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。

　　新鲜配制。

　　显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置30min，脯氨酸

　　显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。

　　也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，

　　于610nm 测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～20μg。

　　5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色

　　试剂：①0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，

　　再用甲醇稀释至100mL）。②15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到

　　100mL。

　　显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置 2h，紫

　　外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。

　　6．羟脯氨酸的显色

　　试剂：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL

　　的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降

　　低，故用时新鲜少量配制。

　　显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯

　　羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不

　　太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基

　　酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。

　　7．色氨酸的显色

　　(1)第一种方法

　　试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。

　　显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸

　　显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。

　　(2)第二种方法：

　　试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。

　　显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘5min，色氨酸在长波长紫外光下

　　呈现荧光（黄-橙-带绿色）。

　　8．酪氨酸的显色

　　试剂：①0.1%α-亚硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。

　　显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘3min，

　　酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。

　　灵敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红

　　色斑点变成红色。

　　9．酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应

　　试剂：①4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。

　　用时取出30mL，在0℃与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）

　　②10%碳酸钠水溶液。

　　显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多

　　肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。

　　第六节 氨基酸定量测定

　　一、氨基酸的一般定量测定

　　（一）甲醛滴定法

　　1．原理

　　氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内

　　盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱

　　溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如

　　下：

　　2．方法特点及应用

　　此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此

　　法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此

　　作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪

　　氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反

　　应，往往使结果偏高。

　　3．操作方法

　　吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL

　　置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至

　　酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。

　　加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消

　　耗氢氧化钠标准溶液毫升数。

　　同时取 80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8．2，

　　（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定

　　至pH9.2，作为试剂空白试验。

　　4．结果计算

　　氨基酸态氮质量分数（%）=

　　式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液

　　的体积，mL；

　　V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

　　c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

　　m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；

　　0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。

　　5．说明

　　①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处

　　理而直接测定。

　　(二)茚三酮比色法

　　1．原理

　　氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），

　　可用吸光光度法测定。

　　该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此

　　可以测定样品中氨基酸含量。

　　2．操作方法

　　(1)标准曲线绘制

　　准确吸取 200μg /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于

　　0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加

　　水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各

　　1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min

　　后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克

　　数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

　　(2)样品测定

　　吸取澄清的样品溶液 1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，

　　用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。

　　3．结果计算

　　氨基酸含量（mg/100g）=

　　式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；

　　m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。

　　4．说明及注意事项

　　①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 5～10g 或吸取样液样品5～10mL，

　　置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL 热水洗

　　涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。

　　②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行

　　纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著《食品检验与分析》。

　　(三)非水溶液滴定法

　　1．原理

　　氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸

　　碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱

　　性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱

　　酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中

　　呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。

　　本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸

　　2．测定

　　(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解

　　于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积

　　的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至

　　同样终点颜色。

　　(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样

　　品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的

　　酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。

　　3．说明

　　(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组

　　氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰

　　醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

　　(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再

　　加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。

　　(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)

　　1．原理

　　邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

　　的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。可能产物为：

　　各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

　　异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

　　酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。

　　本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高 100 倍以上，可测到0.1～

　　1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一

　　种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸

　　不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，

　　但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。

　　(五)三硝基苯磺酸法

　　三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下

　　与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：

　　中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然

　　而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值

　　显著下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。

　　利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm

　　（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条

　　件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度

　　因氨基酸种类而异；在加入适量SO3

　　2－时，吸收值升高。

　　本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。

　　表 10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度

　　氨基酸种类 碱性溶液① 酸性溶液加 SO3

　　①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至4mL，

　　在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol 时的吸光度。

　　②条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处

　　测定。

　　③条件同①，但与 TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。

　　(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法

　　1．原理

　　氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，

　　产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：

　　乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质

　　2．试剂

　　混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，

　　用水稀释至30mL。

　　3．测定

　　取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热10min，

　　冷却，加水2mL，然后测定荧光值。

　　表 10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围

　　化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）

　　甘氨酸 485 2～10

　　苯丙氨酸 490 8～40

　　丝氨酸 485 5～25

　　半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100

　　谷氨酸 485 20～100

　　与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。

　　二、个别氨基酸的定量测定

　　（一）赖氨酸的测定

　　1．原理

　　用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基

　　苯(FDNB)反应,生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,

　　从而求出样品中游离赖氨酸的含量.

　　2．试剂

　　(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。

　　(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。

　　(3)硼酸盐缓冲液（pH9.1～9.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至

　　1000mL 。

　　(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液

　　中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，

　　把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。

　　(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。

　　(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。

　　(7)100g/L 丙氨酸溶液。

　　3．测定

　　(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工

　　作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。

　　(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸

　　取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。

　　(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。

　　(4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。

　　(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃

　　水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。

　　(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。

　　(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨

　　酸-HCl 的含量。

　　本法在 0～40mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

　　4．说明

　　(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度

　　具有良好的线性关系。

　　(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB

　　的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。

　　（二）色氨酸的测定

　　1.原理

　　样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生

　　成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。

　　2．试剂

　　(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3?6H2O)41mg，加入10%三

　　氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。

　　(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。

　　(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

　　置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.

　　3．测定

　　称取样品粉末 100～200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min 速

　　度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40℃

　　水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水

　　解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。

　　吸取滤液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，

　　摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发

　　射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含

　　量。

　　本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

　　测定氨基酸含量的方法有几种
1)称干重法.可用离心法或过滤法测定.优点：可适用于一切微生物,缺点：无法区别死菌和活菌.

　　2)比浊法.原理：由于微生物在液体培养时,原生质的增加导致混浊度的增加,可用分光光度计测定.优点：比较准确.

　　3)测含氮量,大多数微生物的含氮量占干重的比例较一致,根据含氮量再乘以6.25即可测得其粗蛋白的含量.

　　4)血球计数板法.优点：简便、快速、直观.缺点：结果包括死菌和活菌.

　　5)液体稀释法.对未知菌样作连续的10倍系列稀释,经培养后,记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查MPN表,再根据样品的稀释倍数就可计算其中的活菌含量.优点：可计算活菌数,较准确.缺点：比较繁琐.

　　6)平板菌落计数法.取一定体积的稀释菌液涂布在合适的固体培养基,经培养后计算原菌液的含菌数.优点,可以获得活菌的信息.缺点：操作繁琐,需要培养一定时间才能获得,测定结果受多种因素的影响.

　　标签: 氨基酸总量测定